国際心臓血管研究ジャーナル

Na3PO4 を用いた大動脈弁石灰化の in vitro 動物モデルの強化

ダニエル・アレハンドロ・レルマン、サイ・プラサド、ナスリ・アロッティ

Na ₃ PO ₄を用いた大動脈弁石灰化のin vitro動物モデルの強化

背景/目的:石灰化大動脈弁疾患(CAVD)の発症には、特定の骨形成シグナル伝達経路とアポトーシスの活性化を特徴とする弁間質細胞 (VIC) の活発な炎症プロセスが関与しています。このプロセスは、自発的石灰化の特定の分子マーカーと遺伝子発現経路を分析することで研究できます。私たちの研究の目的は、石灰化促進剤としてのリン酸ナトリウム (Na ₃ PO _{4 ) の役割を調査し、潜在的な石灰化抑制剤を試験するための}in vitro動物モデルを改善することです。

材料と方法: VIC は、6 個の健康な 6 ヶ月齢の新鮮なブタの心臓から連続コラーゲナーゼ消化によって抽出されました。定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) を使用して、VIC の自​​然石灰化中の目的遺伝子の分化転換を定量化しました。VIC の自​​然石灰化は、Na ₃ PO ₄ (3 mM、pH 7.4) を添加することで増加しました。石灰化の程度は、カルシウム沈着についてはアリザリン レッド染色、コラーゲンについてはシリウスレッド染色によって推定しました。比色法を使用して、カルシウムとコラーゲンの沈着を定量的に決定しました。さらに、アルカリホスファターゼ (ALP) の酵素活性を速度論的アッセイによって測定しました。統計分析には、SPSS と Microsoft Office Excel 2013 を使用しました。

結果:ブタの VIC は自発的に石灰化し、カルシウムとコラーゲンの沈着が明らかになりました。本研究では、0 日目から 14 日目にかけてカルシウムとコラーゲンの沈着が増加することが観察されました (カルシウム: 376%、P<0.001、コラーゲン: 3553%、P<0.001)。14 日目までの mRNA の qPCR 分析では、次の結果が示されました。筋芽細胞表現型のマーカーである α-アクチンは 1.6 倍に増加しました (P<0.001)。骨芽細胞マーカーである Runx2 は 1.3 倍に上昇しました (P<0.05)。骨形成を促進する TGF-β は 3.2 倍に増加しました (P<0.001)。筋芽細胞の結節形成を制御する RhoA は 4.5 倍に増加しました。 0日目のレベルと比較すると、P<0.001でした。RANKL mRNAとカルポニンには有意な変化はありませんでした。豚VICをNa ₃ PO ₄ (3 mM、pH 7.4)で処理すると、14日目までにカルシウム沈着が著しく増加し (522%、P<0.001)、7日目までにALP活性が大幅に増加しました (228%、P<0.05)。14日目までに、グループ間のALP活性に有意な変化はありませんでした。

結論:この研究では、大動脈 VIC の自​​発的な石灰化中に、カルシウム、コラーゲン、ALP 活性の活発な増加を伴う特定の分子の上方制御が実証されました。このin vitroモデルでは、Na ₃ PO ₄ (3 mM、pH 7.4) で自発的な VIC 石灰化を増加し、石灰化阻害剤をテストして石灰化大動脈狭窄に対する新しい潜在的な治療戦略を特定できるレベルまで高めることができました。